项目简介

噬和凋亡是维持细胞稳态，清除异常细胞、细胞器的两种不同方式。在2型糖尿病发生发展中，自噬和凋亡对维持胰岛β细胞结构、分泌能力及内环境的稳定起着重要作用。青钱柳是我国特有的单种属植物，民间有以其树叶制作茶汤饮用的习俗，而长期饮用人群健康长寿，糖尿病发生概率低。已有研究发现青钱柳中三萜类成分对2型糖尿病有较好的治疗作用，并初步证实可能与其清除ROS、抗凋亡和诱导自噬有关。基于此，本项目拟通过复制2型糖尿病大鼠模型和高糖高脂致胰岛INS-1细胞损自伤模型，运用流式细胞术、免疫荧光、Real-timePCR、Western-blot等技术，研究2型糖尿病时ROS及自噬和凋亡互反馈调控作用，并在此基础上，探寻青钱柳中三萜类成分防治2型糖尿病的主要作用靶点，证实其通过清除ROS，调节自噬和凋亡互反馈调控平衡，来发挥治疗2型糖尿病作用的分子机制，为青钱柳防治2型糖尿病提供理论基础和实验依据。

项目前期基础

青钱柳具有清热消肿、解毒止痛功能。民间以其叶制作的茶汤已证实有降糖效果。我们采用大孔树脂、硅胶、半制备高效液相等柱色谱技术以及重结晶等方法对青钱柳叶三萜化合物进行了分离纯化，获得了8个三萜单体：β-香树脂醇、熊果酸、齐墩果酸、白桦脂酸、β-乳香酸、科罗索酸、马斯里酸、阿江榄仁酸；随后进行的高糖高脂致INS-1细胞氧化损伤实验中，发现青钱柳中三萜化合物能显著增加高糖高脂致INS-1细胞氧化损伤的存活率，抗凋亡、诱导自噬和改善细胞形态，其作用机制与稳定INS-1细胞膜、清除ROS及调节INS-1细胞内凋亡和自噬相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9和LC3-Ⅱ的表达有关。

项目立项的重要性与必要性

随着们人们生活方式的改变和人口老龄化，糖尿病的发病率和死亡率逐年升高，已经成为继心脑血管疾病、肿瘤之后严重危害人类健康的第三大慢性病。据世界卫生组织预测，全球糖尿病患者将从年的2.46亿例增至年的3.8亿例，至年，发展中国家的2型糖尿病患者数可能占全球的76％。2型糖尿病又称非胰岛素依赖性糖尿病，占糖尿病患者90%以上[1]。因此，探索糖尿病特别是2型糖尿病的发病机制是十分必要的，同时如何最大程度地控制血糖，减轻2型糖尿病及其并发症也成为医学界的研究热点之一。中医药在糖尿病的防治方面有其独特的优势，许多中药及复方对胰岛功能减退、胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗等有良好的防治效果，同时它与合成药物相比，具有易于接受和毒副作用小的优势。近年来通过药物化学和药理学研究手段，对中药治疗糖尿病药效物质基础进行了研究，从中发现了部分具有良好治疗糖尿病的药物，如人参多糖、知母多糖、灵芝多糖、三七皂苷、野葛糖苷、人参皂苷、苦瓜皂苷[2]。因此，积极利用现代研究手段找寻防治糖尿病的中药及阐明其治疗糖尿病的物质基础，将有助于开发高效的预防与治疗糖尿病的中药新药。

现代医学认为，多种生物活性分子及细胞内信号转导通路，如糖尿病高血糖时，由于活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）的产生及中性粒细胞活化等可导致炎症、细胞凋亡和损伤；另外，高糖还可通过激活还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶使细胞内尤其是血管内皮细胞内ROS产生增加。糖尿病脂代谢紊乱的特征是TG的增高和HDL-C降低。TG增高时，游离脂肪酸（FFA）产生增多，FFA增高可导致线粒体ROS生成增多，同时还通过减少细胞内的GSH，损害抗氧化防御系统加剧氧化应激[3]。大量研究表明，糖尿病后自噬增强，而且与胰岛β细胞死亡密切相关。因此，利用细胞的内源性保护机制来使损伤降到最小，成为当今糖尿病研究重点[4-5]。目前，尚不完全清楚自噬对哺乳动物胰岛β细胞是保护作用还是损伤作用。大量的在体、离体和细胞实验发现，在糖尿病胰岛β细胞中均有明显的自噬现象。目前认为，不管是在基础水平还是激活状态下，自噬对于防止胰岛β细胞凋亡并维持其数量起着重要作用，但过于严重和持久的高血糖却可抑制自噬；更为重要的是，如果不适当的激活自噬可能会加速细胞死亡。至于细胞自噬在糖尿病时到底是有利还是有害，目前多数学者认为其在2型糖尿病中起“双刃剑”的作用，它在激活和抑制之间的平衡将决定“双刃剑”的走向[5-6]。因此，糖尿病可诱导产生自噬，而自噬的程度就是其“双刃剑”作用的核心问题。当自噬被严格调控到适度时，细胞可通过其分解自身物质提供能量及氨基酸、核苷酸等营养物质，促进或维持高血糖或胰岛素抵抗后的β细胞存活，才利于维持细胞在应激状态下的基本功能，发挥应激防御作用。因此，调控β细胞的自噬程度应该是使这把“双刃剑”转向细胞保护作用的关键。在2型糖尿病时，自噬与凋亡的互反馈调控将直接决定着β细胞最终的命运。近年来，随着研究的深入，学者们发现进行自噬与凋亡的互反馈调控有可能成为防治2型糖尿病的新靶点，这一点与中医对2型糖尿病的病因病机的认识及防治不谋而合。中医认为2型糖尿病阴虚燥热,阴虚为本、燥热为标，两者互为因果，属本虚标实之证；而自噬正是机体对正虚邪实作出的一种自我调节方式，但其本身的太过与不及同样是重要的致病因素。临床实践证实具有滋阴清热中药对2型糖尿病有良好疗效。因此采用传统的滋阴清热疗法来进行2型糖尿病的治疗研究有着深远的意义。

青钱柳为广泛应用的草药，为我国特有的单种属植物，自古以来产地居民以它的树叶制作茶叶来饮用，因具有降血糖、清热消肿、止痛等功能被称之为“神茶”。其化学成分与药理活性研究显示确有降血糖、降血压、降血脂、延缓衰老、消除疲劳等作用[7-11]，这为进行此项研究提供了极好的理论依据。同时我们的前期研究也证实青钱柳及其三萜类成分治疗2型糖尿病可能与其清除ROS、抗胰岛β细胞凋亡和诱导自噬有关。但青钱柳中三萜类成分是如何通过清除ROS、调控自噬与凋亡互反馈平衡，诱导胰岛β细胞适度自噬来发挥其治疗2型糖尿病的作用还有待阐明。

基于此，本项目拟通过复制2型糖尿病大鼠模型和高糖高脂致胰岛INS-1细胞损伤模型，运用流式细胞术、电镜、免疫荧光、Real-timePCR、Western-blot等技术，研究2型糖尿病时ROS及自噬和凋亡互反馈调控作用，探寻青钱柳中三萜类成分防治2型糖尿病的主要作用靶点，证实其通过清除ROS，调节自噬和凋亡互反馈调控平衡，诱导细胞适度自噬，促使自噬“双刃剑”作用转向细胞保护来发挥治疗2型糖尿病的分子机制，为青钱柳防治2型糖尿病提供理论基础和实验依据。

参考文献

[1]汪启航,雷荣,廖凤霞.医院用药市场分析[J].世界临床药物,,33(11):-.

[2]蔡仲德,吴杰,朱惠荣.中医药治疗糖尿病研究概况[J].中国实验方剂学杂志,,8(6):56-59.

[3]YuT,RobothamJL,YoonY.Increasedprodutionofreactiveoxygenspeciesinhyperglycemicconditionrequiresdynamicchangesofmitochondrialmorphology[J].ProcNatlAcadSciUSA,,(8):-.

[4]LiangC.Negativeregulationofautophagy[J].CellDeathDiffer,,17(12):-.

[5]LeiX,BoneRN,AliT,etal.Geneticmodulationofisletβ-celliPLA2βexpressionprovidesevidenceforitsimpactonβ-cellapoptosisandautophagy[J].Islets.,PMID:[PubMed-assuppliedbypublisher].

[6]WangY,LiYB,YinJJ,etal.Autophagyregulatesinflammationfollowingoxidativeinjuryindiabetes[J].Autophagy,,9(3):-.

[7]谢明勇,谢建华.青钱柳研究进展.食品与生物技术学报,,27(1):-.

[8]黄鑫,黄敏,童雪燕,等.青钱柳降血糖药效物质基础研究进展.安徽农业科学,,37(23):-.

[9]范冰舵,魏颖,李沧海,等.青钱柳化学成分及降血糖活性研究概况.中国实验方剂学杂志,,20(13):-.

[10]崔保松,李帅.青钱柳叶的化学成分研究.中草药,,43(11):-.

[11]李田,上官新晨,尹忠平,等.青钱柳叶三萜化合物分离与鉴定.江西农业大学学报,,35(5):-.