1.通讯作者及单位：JieYang，中国药科大学

2.摘要：

背景、目的：结直肠癌是全球第三大常见癌症。HER2和HER3是人类表皮受体家族中酪氨酸激酶受体(RTKs)的两个成员，与结直肠癌的低生存率有关，被认为是各种癌症的重要治疗靶点。科罗索酸是一种天然的五环三萜类化合物，已被证明具有显著的抗癌活性，但其靶点未知。作者旨在揭示其抗癌活性的直接靶点。

实验方法：通过磷酸化RTK阵列、生物膜干涉、免疫共沉淀和邻位连接实验（PLA）揭示了科罗索酸的靶点。以HCT和SW细胞为研究对象，研究了科罗索酸对HER2/HER3异源二聚化及其下游信号转导的抑制作用。此外，还在HCT异种移植模型和AOM/DSS模型中验证了科罗索酸的化疗预防作用。

主要结果：科罗索酸可以阻止NRG1诱导的HER2/HER3异源二聚，并抑制HER2和HER3的磷酸化。此外，HER2和HER3分别调节RalA/RalBP1/CDK1和PI3K/Akt/PKA下游信号通路，导致Drp1磷酸化和线粒体动力学的改变。科罗索酸在HCT异种移植模型和AOM/DSS模型中均显示出一定的抗癌活性。

结论、意义：科罗索酸通过调节RalA/RalBP1/CDK1和PI3K/Akt/PKA通路，直接靶向HER2和HER3异源二聚，并抑制线粒体分裂。揭示了科罗索酸对结直肠癌有益作用的新机制。

3.前言：

结直肠癌是全球第三大常见癌症，年约有万新确诊病例和88.1万新增死亡病例。HER2和HER3是酪氨酸激酶受体(RTKs)中人类表皮受体(EGFR/HER/ERBB)家族的两个成员，介导癌细胞的分化、增殖和迁移。肿瘤中的HER2和HER3水平与结直肠癌患者生存率的降低直接相关。有趣的是，虽然her2没有确定的配体，但它是形成异源二聚体的首选伙伴。同时，由于HER3缺乏内源性激酶活性，HER3的激活依赖于配体(neuregulin1/NRG1和neuregulin-2/NRG2)与其他HER受体的结合和/或异源二聚化。在EGFR/HER活性所必需的同源二聚体和异源二聚体中，HER2/HER3异源二聚体被认为是激活下游信号的最有效的一对。因此，HER2和HER3已成为各种癌症，特别是HER2阳性癌症的重要治疗靶点。

天然的五环三萜科罗索酸已被证明具有许多活性，如抗糖尿病和抗炎活性。科罗索酸对几种癌症也显示出良好的细胞毒活性，如肺癌、结肠癌。研究已表明科罗索酸可以抑制蛋白激酶C或激活AMPK，但其直接靶点尚未被探索。

该文作者目标是发现科罗索酸发挥抗癌活性的直接靶点，结果表明科罗索酸与HER3胞外区有很好的亲和力，可以抑制HER2/HER3异二聚体的形成，从而在体内外调节线粒体的分裂。作者证明了科罗索酸可以通过直接靶向HER2/HER3异二聚化来抑制结直肠癌。同时，HER2/HER3异源二聚体可以介导线粒体分裂，这是一种新的线粒体动力学调控机制。

4.结果：

（1）科罗索酸能防止NRG1诱导的HER2/HER3异二聚化

RTK在细胞分化和生存中发挥重要作用，且在许多类型的癌症中常被异常激活，因此被认为是癌症治疗的热门靶点。作者利用磷酸化RTK芯片研究了科罗索酸对RTKs的影响以探索其靶点，结果SW和HCT细胞中的p-anexelekto(Y)、p-ALK(Y)和p-HER2(Y)在科罗索酸处理后均发生显著变化（Fig.1a,b）。进一步WB结果科罗索酸显著降低p-HER2(Y)，而不显著改变p-anexelekto(Y)和p-ALK(Y)的水平（Fig.1c）。作者推测科罗索酸可能主要靶向结直肠癌的HER家族（主要有HER1、HER2、HER3、HER4）。BLI分析科罗索酸与HER家族的相互作用，结果科罗索酸不能与EGFR相互作用，与HER2、HER3和HER4的平衡解离常数分别为8.84mM、42.2μM和2.49mM，表明可与HER3强烈结合（Fig.1d）。此外，分子对接表明科罗索酸与HER3空腔的Cly、Arg、Ser和Pro形成稳定的氢键（Fig.1e）。BLI分析法的竞争性结合实验的结合反应信号在科罗索酸孵育后没有改变（Fig.S1a），表明科罗索酸不能阻断HER3与NRG1的结合。HER2/HER3异源二聚体是激活HER2所必需的。免疫沉淀和PLA结果显示，科罗索酸可以阻止NRG1诱导的HER2/HER3异源二聚体的形成（Fig.1f,g,S1b），从而降低HER2和HER3的磷酸化。以上结果表明科罗索酸能够阻断NRG1诱导的HER2/HER3异源二聚，从而抑制结直肠癌中的HER2和HER3磷酸化（Fig.1h）。

Figure1.Corosolicacid(CRA)preventsNRG1-inducedHER2/HER3heterodimerization.(a)Aphospho-RTKantibodyarraywasusedtoassessphosphorylatedlevelsofvariousRTKsinSW(left)andHCT(right)afterCRAtreatment.(b)Thereceptorschangedby20μMCRAinSWandHCTcells(up-regulated≥1.5-foldordown-regulated≤0.67-fold).(c)Thelevelsofp-anexelekto(Axl/Y),p-ALK(Y),andp-HER2(Y)wereevaluatedbywesternblotting,andtheirrelativeintensitywerecalculatedbyImageJ.*P.05vs.untreatedgroup.(d)ThebindingaffinityofCRAwithHER1,HER2,HER3,andHER4weremeasuredbybio-layerinterferometryassay.(e)TheinteractionbetweenHER3andCRAwereanalysedbymoleculardocking.(f)ImmunoprecipitationofHER2withHER3inSWcellstreatedwithCRAorNRG1orboth.*P.05vs.untreatedgroup,#P.05vs.grouptreatedwithNRG1only.(g)TheinteractionbetweenHER2andHER3(reddots)inSWcellswasperformedbyproximityligationassay(PLA).(h)AmodelfortheinhibitoryactionofCRAonHER2/HER3heterodimer.Dataareexpressedasthemean±SD(n=5).

（2）科罗索酸调节HER2介导的Rala/RalBP1/CDK1和PI3K/AKT/PKA信号通路

作者研究了科罗索酸对HER2/HER3下游信号通路的影响。WB结果表明科罗索酸处理后，PI3K/Akt/PDE3B信号通路受到抑制，而ERK1/2信号通路没有受到抑制，同时PKA水平呈剂量依赖性增加（Fig.2a）。此外，科罗索酸还可降低RalA的表达，促进RalBP1从线粒体向胞浆的移位，从而下调CDK1的表达（Fig.2b）。siRNA沉默HER2后SW和HCT细胞中RalA和CDK1的表达降低，提示HER2在Rala/RalBP1/CDK1信号转导中起重要作用（Fig.2c,d）。

Figure2.Corosolicacid(CRA)regulatedHER2-mediatedRalA/RalBP1/CDK1andPI3K/Akt/PKAsignalling.(a)TheproteinexpressionsofPI3K,P-Akt,PDE3BandPKAinSWandHCTcellsafterCRAtreatmentweremeasuredbywesternblotting.*P.05vs.untreatedgroup.(b)TheexpressionsofRalA,CDK1andRalBP1inmitochondrial(Mito)orcytosolic(Cyto)inSWandHCTcellsafterCRAtreatmentweremeasuredbywesternblotting.*P.05vs.untreatedgroup.(c)SWandHCTcellswereindividuallytransfectedwithtwoHER2siRNAsorcontrolsiRNA.TheexpressionsofRalAandCDK1inSWandHCTcellstransfectedwithHER2siRNAorcontrolsiRNAwasmeasuredbywesternblotting.*P.05vs.controlsiRNAgroup.(d)TheproposedsignallingpathwayregulatedbyCRA.CRAregulatedRalA/RalBP1/CDK1andPI3K/Akt/PKAsignalling,partlybyblockingHER2/HER3heterodimerization.TherelativeintensitiesofproteinswerecalculatedbyImageJ.Dataareexpressedasthemean±SD(n=5).

（3）科罗索酸通过HER2或HER3介导的Drp1磷酸化抑制线粒体分裂

CDK1使Drp1的Ser磷酸化促进线粒体分裂，而PKA依赖的Drp1Ser磷酸化抑制线粒体分裂。由于科罗索酸抑制了CDK1、增加了PKA的表达，作者研究了科罗索酸是否可以调节DRP1的磷酸化从而影响线粒体的动力学。结果科罗索酸抑制了Drp1Ser的磷酸化，增加了Drp1Ser的磷酸化，同时抑制了Drp1从细胞质到线粒体的易位（Fig.3a-c）。科罗索酸处理后，观察到线粒体延长，这与线粒体分裂抑制剂Mdivi-1处理的结果一致（Fig.3d）。此外，线粒体动力学也受到Mfn1/2和OPA1的调节，但科罗索酸对Mfn1/2和OPA1的表达无明显影响，表明其主要通过调节DRp1的磷酸化来抑制线粒体的分裂。

Figure3.Corosolicacid(CRA)preventsmitochondrialfissionviaDrp1phosphorylation.(a)Theexpressionsofp-Drp1(Ser)andp-Drp1(Ser)inSWandHCTcellsafterCRAtreatmentwereinvestigatedbywesternblotting.(b)TheeffectsofCRAonthelevelsofDrp1inmitochondrial(Mito)orcytosolic(Cyto)fractionsofSWandHCTcellswereinvestigatedbywesternblotting.(c)ViewofmitochondriallocalizationofDrp1byconfocalscanningmicroscope(red:MitoTrackerRedCMXRos;green:DRP1).TheDrp1punctalocalizationtomitochondriawassignedbyarrowheads.Drp1punctapermitochondriallengthwasquantified(50mitochondrialforeachgroupinfiveindependentexperiments).(d)MitochondrialdynamicinSWandHCTcellswereviewedwithMitoTrackerRedCMXRosbyconfocalmicroscopy.Scalebar,5μm.TherelativeintensityofproteinsandmitochondriallengthswerecalculatedbyImageJ.Dataareexpressedasthemean±SD(n=5).*P.05vs.untreatedgroup.

作者还探索了HER2或HER3是否与线粒体分裂有关。分别用HER2或HER3的siRNA转染SW和HCT细胞，WB结果显示HER2的敲除抑制了Drp1在Ser的磷酸化，而HER3的沉默既增加了Drp1Ser处的磷酸化又降低了Ser处的磷酸化（Fig.4a,b）。免疫荧光结果也支持HER2或HER3基因敲除可以阻止SW和HCT的线粒体分裂（Fig.4c）。以上结果为HER2或HER3介导线粒体分裂提供了证据（Fig.4d）。

Figure4.HER2orHER3directlymediateDrp1phosphorylationandmitochondrialfission.Theexpressionsofp-Drp1(S)andp-Drp1(S)weredeterminedbywesternblotting(aandb)andmitochondrialfissionviewedbyconfocalmicroscopy(c)inSWandHCTcellstransfectedwithHER2siRNA,HER3siRNA,orcontrolsiRNA,respectively.(d)Theproposedmechanismsunderlyingtheinhibitoryeffectofcorosolicacid(CRA)onmitochondrialfission.CRApreventsmitochondrialfissionviaDrp1phosphorylationatSandSmediatedbyHER2orHER3.TherelativeintensityofproteinsandmitochondriallengthwerequantifiedbyImageJ.Dataareexpressedasthemean±SD(n=5).*P.05vs.controlsiRNAgroup.

（4）Drp1参与了科罗索酸诱导的结肠癌细胞凋亡

线粒体分裂与细胞凋亡的启动有关。流式细胞分析显示科罗索酸以剂量和时间依赖的方式诱导细胞凋亡（Fig.5a,b），还以剂量和时间依赖的方式增加了Bax/Bcl比值、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9（Fig.5c）。

Figure5.Corosolicacid(CRA)inducedapoptosisincoloncancercells.ThepercentagesofapoptoticcellsweremeasuredbyflowcytometrywithAnnexinV/PIstaininginSWcellsafterincubationwithCRAindifferentconcentrationsfor24h(a)or20μMCRAfordifferenttimes(b).(c)TheproteinexpressionsofBcl-2,Bax,caspase3,caspase9,cleaved-caspase3(CCaspase3),andcleaved-caspase9(CCaspase9)inSWandHCTcellsafterCRAtreatmentweredeterminedbywesternblotting.TherelativeintensityofproteinswasquantifiedbyImageJ.Dataareexpressedasthemean±SD(n=5).*P.05vs.untreatedgroup.

为研究Drp1在科罗索酸诱导的细胞凋亡中的作用，用Drp1siRNA转染SW和HCT细胞。结果20μM科罗索酸分别诱导SW和HCT细胞凋亡约30%和40%（Fig.6a,b），而Drp1敲除消除了该影响。此外，在SW和HCT细胞中，Drp1敲除也抑制了由科罗索酸刺激的cleaved-caspase3的活性（Fig.6c,d）。上述结果表明Drp1在科罗索酸诱导的SW和HCT细胞凋亡中都是必需的（Fig.6e）。

Figure6.Drp1isinvolvedintheCorosolicacid(CRA)-inducedapoptosisincoloncancercells.SWandHCTcellsindividuallytransfectedwithtwoDrp1siRNAsorcontrolsiRNA.Thenthepercentageofapoptoticcells(aandb)andtheexpressionsofcaspase3andcleaved-caspase3(CCaspase3)(candd)wasdetectedinSWandHCTcellstransfectedwithDrp1siRNAorcontrolsiRNAfollowedbyCRAtreatment.(e)TheproposedmechanismresponsibleforCRA-inducedapoptosis.CRAregulatesDrp1phosphorylationandpreventsmitochondrialfission,therebyincreasingcleavedcaspase-3/9andleadingtoapoptosis.TherelativeintensityofproteinswasquantifiedbyImageJ.Dataareexpressedasthemean±SD(n=5).*P.05vs.controlsiRNAgroup;#P.05vs.grouptreatedwithcontrolsiRNAandCRA.

（5）科罗索酸抑制HCT异种抑制小鼠的肿瘤生长

为了证实CRA在体内的作用，作者建立了HCT异种移植小鼠模型。16天的科罗索酸处理对小鼠的体重没有显著影响，表明科罗索酸没有明显的副作用（Fig.7b）。与对照组相比，科罗索酸显著降低了结直肠癌异种移植瘤的生长和肿瘤重量（Fig.7a,c,S5a,b）。此外，科罗索酸激活HCT异种移植瘤中caspase3的活性（Fig.7d）。以上结果证实了科罗索酸对HCT异种移植小鼠的肿瘤生长有抑制作用。

此外，科罗索酸降低了肿瘤组织中HER2和HER3的磷酸化（Fig.7e）。与体外研究结果一致的是，科罗索酸还降低了CDK1的表达，提高了PKA水平（Fig.7f）。与对照组相比，科罗索酸治疗组在Ser位的DRp1磷酸化受到抑制，而在Ser位的磷酸化增强（Fig.7g）。同时，科罗索酸阻止了drp1从胞浆到线粒体的移位，并阻止了线粒体的分裂（Fig.7g,S5c）。

Figure7.Corosolicacid(CRA)inhibitstumourgrowthinHCTxenograftmousemodel.ThenudemicewerekilledafterCRAadministration(CRA-L,10mg/kg?1;CRA-H,30mg/kg?1)for16days.(a)Tumourimagesofeachgrouptakenbycamera(n=6eachgroup),(b)bodyweightchangesinmiceduringthe16daysofCRAtreatment.(c)Tumourvolumesweremeasuredevery2daysduringthetreatmentperiod.(d-h)Theexpressionsofcaspase3,cleaved-caspase3(CCaspase3)(d),orp-HER2,p-HER3(e),orCDK1,PKA(f),orp-Drp1(S),p-Drp1(S)(g),orDrp1inmitochondrial(Mito)andcytosolic(Cyto)fractions(h)intumourtissuesweredeterminedbywesternblotting.TherelativeintensityofproteinswasquantifiedbyImageJ.Dataareexpressedasthemean±SD(n=5).*P.05vs.controlgroup.

（6）科罗索酸对AOM/DSS小鼠模型结肠肿瘤生长的抑制作用

用AOM/DSS小鼠模型验证CRA的体内抑制作用（Fig.8a）。与模型组相比，口服科罗索酸可显著降低DAI指数（Fig.8b）。科罗索酸治疗后，肿瘤负荷和肿瘤数量都显著减少（Fig.8c-e）。值得注意的是，科罗索酸主要抑制结肠中远端肿瘤的发生。HE染色显示与科罗索酸治疗组相比，AOM/DSS小鼠出现严重的腺体发育不良、腺瘤和腺癌（Fig.8f）。同时，科罗索酸可激活AOM/DSS小鼠模型中的caspase3活性（Fig.9a）。STAT3是触发炎症诱导癌症的关键分子，与模型组相比，科罗索酸处理组的STAT3磷酸化水平显著降低且抑制了IL6诱导的SW细胞中STAT3的激活，表明科罗索酸至少部分是通过抑制炎症来抑制结直肠癌的（Fig.9b,c）。

此外，科罗索酸还影响HER2和HER3的磷酸化以及下游信号通路（Fig.9d,e）。与模型组相比，科罗索酸治疗组可抑制线粒体分裂并介导Drp1的磷酸化或易位（Fig.9f,g,S6b）。这些结果提示HER2、HER3与线粒体动力学共同参与了科罗索酸对AOM/DSS小鼠模型的有利作用。

Figure8.Corosolicacid(CRA)inhibitscolontumourgrowthinAOM/DSSmicemodel.(a)TheexperimentalproceduresofAOM/DSSmicemodels.(b)Diseaseactivityindexweremeasuredonceaweek.(c)Photographicimagesofcolontissues.(d)ThetumournumbersindifferentsegmentsofcolorectuminmodelandCRAtreatmentgroups.(e)Tumourload.(f)RepresentativeHEstainingimagesofcolorectaltissues.ThesampleswerescannedbyNanoZoomer2.0.Therectangleineachuppermicrograph(scalebar:2.5mm)wasmagnifiedonthebottom(scalebar:μm).Dataareexpressedasthemean±SD(n=8eachgroup).*P.05vs.controlgroup.#P.05vs.modelgroup.

Figure9.Corosolicacid(CRA)inhibitsmitochondrialfissionregulatedbyHER2/HER3inAOM/DSSmicemodel.(a,bandd–g)Theexpressionsofcaspase3,cleaved-caspase3(CCaspase3)(a),orp-STAT3(b),orp-HER2,p-HER3(d),orCDK1,PKA(e),orp-Drp1(S),p-Drp1(S)(f),orDrp1inmitochondrial(Mito)andcytosolic(Cyto)fractions(g)incolontissueweredeterminedbywesternblotting.*P.05vs.controlgroup;#P.05vs.modelgroup.(c)SWcellswerepretreatedwithIL-6andthenincubatedwithorwithoutCRAfor4h.Theexpressionofp-STAT3wasdeterminedbywesternblotting.TherelativeintensityofproteinswasquantifiedbyImageJ.Dataareexpressedasthemean±SD(n=5).*P.05vs.untreatedgroup;#P.05vs.IL-6onlytreatedgroup.

5.结论与创新点：

天然的五环三萜科罗索酸已被证明具有抗糖尿病、抗炎和抗肿瘤活性，研究表明科罗索酸可以抑制蛋白激酶C或激活AMPK，但直接靶点未知。作者通过磷酸化RTK阵列和WB发现了科罗索酸降低p-HER2(Y)磷酸化水平，采用BLI、IP和PLA进一步发现科罗索酸可以阻止NRG1诱导的HER2/HER3异源二聚体的形成，HER2/HER3异源二聚体又是激活HER2所必需的，基于以上发现作者进一步研究了科罗索酸对结肠癌的治疗作用。本文寻找科罗索酸靶点的手段可参考，科罗索酸作为HER2/HER3异源二聚体形成抑制剂在HER2阳性肿瘤靶向治疗中的作用值得进一步评估。

DOI:10./bph.